混合菌群调节果蝇产卵偏嗜性

　　摘要：【目的】利用果蝇产卵偏嗜性作为评价指标，研究影响混合菌群平衡的因素及竞争机制，并揭示混合菌对果蝇后代存活率的影响。【方法】将植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、大肠杆菌(Escherichiacoli)和二者混合菌发酵处理酪蛋白琼脂食物;利用双向选择产卵器检测成年雌性果蝇的产卵偏嗜性;平板计数法检测细菌数量;通过蛹存活率探究两菌互作对果蝇存活率的影响。【结果】在37℃发酵果蝇食物，果蝇喜欢在植物乳杆菌底物上产卵，而厌恶在大肠杆菌底物上产卵，同时对等比例混合菌具有显著的产卵避性，产卵指数为-0.46，说明果蝇产卵偏嗜性可作为一个研究混合菌群平衡的模型。增加混合菌中植物乳杆菌比例可降低果蝇产卵避性，甚至逆转，说明接种比例影响着菌群平衡。涂板计数证实，大肠杆菌数量在培养基中占据优势，是植物乳杆菌的4.43倍，所以引起果蝇产卵避性。当植物乳杆菌与大肠杆菌等比例混合后改变培养温度，25℃对应的产卵指数为0.41，30℃对应的产卵指数为-0.06，35℃对应的产卵指数为-0.45，说明温度影响着菌群平衡。植物乳杆菌代谢物，特别是乳酸可抑制大肠杆菌生长，从而间接地调控果蝇产卵偏嗜性。大肠杆菌占据着优势时，蛹存活率仅为14%，而植物乳杆菌占据着优势时，蛹存活率为91%，说明混合菌生长平衡影响果蝇存活率。【结论】接种比例与温度是影响菌群平衡的关键因素，果蝇根据菌群平衡而调整其产卵行为，以提高后代的存活率。

　　关键词:植物乳杆菌，大肠杆菌，接种比例，温度，产卵偏嗜性，存活率

　　大多数自然环境都存在着大量的微生物。最近，分子生物学方法，如宏基因组测序和深度微生物标记测序，已经揭示了微生物的多样性和复杂性。在菌群中细菌个体间不断发生着相互交流，产生社会行为，这些信息可塑造微生物群落的结构平衡。

　　在这些社会行为中，最为显著的关系便是竞争，细菌之间相互争夺有限的空间和资源，可以抑制甚至杀死其他微生物[1]。通常认为，数量上占优势的微生物种群源自一个高度多样化、低丰度的起始种群。某些稀有成员在适宜的条件下快速增殖，可以实现种群爆发，打破原有平衡，成为优势种群[2]。因此，揭示影响群落成员的因素对理解和调控菌群平衡具有重要研究和应用价值。

　　然而，自然群落复杂而又多变，直接研究它会困难重重，亟需某些模式菌种构建研究模型。果蝇的共生菌种类较为繁多[3]，多达20多种，广义上既包括益生菌，如植物乳杆菌和肠球菌等，又包括有害细菌，如条件致病菌大肠杆菌和真菌等[4]。研究发现，植物乳杆菌在果蝇肠道内能发酵碳水化合物产生代谢产物，特别是乳酸，能维持果蝇肠道内低pH环境，抑制大肠杆菌的生长与繁殖[5]。同时，植物乳杆菌具有提高机体免疫力、维持肠道内菌群平衡和促进营养物质的吸收等多种作用[6]。大肠杆菌是肠杆菌科革兰阴性菌，主要栖生于人和动物大肠内。

　　其既能在宿主体内生存,也能吸附在环境中固体介质表面，形成生物膜而得以存活和传播[7]。大肠杆菌是果蝇体内的条件致病菌，当大肠杆菌过度繁殖时，会阻碍果蝇卵的生长和发育，甚至导致其死亡[8]。这两种细菌常存在于果蝇体内和周围，但目前仍然不清楚哪些因素可以影响二者之间竞争平衡。尽管高通量测序可以解析菌落物种结构和平衡，然而迄今为止尚缺乏一种简单易行的检测微生物竞争结果的指示方法，正成为后基因组时代的一大挑战。由于果蝇产卵需要消耗母体大量的能量和营养，并且幼虫运动能力弱，容易遭受天敌攻击。

　　因此，为促进后代的生长和发育，雌性果蝇在产卵之前，必须利用多种感觉系统[9]，并且综合多种因素，最终才会选择在适宜的地方产卵[10-11]。果蝇产卵的选择是果蝇一个非常重要的行为，该行为易于观察和量化，对刺激敏感，并且抗外界干扰因素强，可为我们提供一个生物指示剂以研究菌群平衡[11]。因此，本研究尝试将果蝇作为指示生物，通过其产卵选择性判断菌群平衡，并进一步探讨影响混合菌群平衡的因素及竞争机制。

　　1材料和方法

　　1.1果蝇品系与培养方法

　　本研究选用野生型黑腹果蝇品系OregonR(OR)和CantonS(CS)作为实验材料。如无特别说明，所有果蝇均培养在温度25℃、相对湿度60%的恒温箱中，培养光周期为12L：12D[12]。在通常情况下，果蝇使用玉米-酵母培养基饲养，由于酵母粉中成分复杂，为避免酵母对果蝇产卵行为的影响，行为学分析中使用的果蝇食物为水解酪蛋白-蔗糖-琼脂培养基。

　　1.2试剂与仪器

　　试剂：Walch消毒液(广州威莱);次氯酸(Sigma);酵母(安琪);MRS琼脂培养基;麦康凯琼脂培养基。仪器：25℃恒温恒湿培养箱(恒丰,WS-01Y);天平(DenverInstrument,XE-310);显微镜(OlympusSZX7;NikonSMZ745T);低温高转速离心机(上海力申，Neofuge13R);分光光度计(岛津，UV-1800)。

　　1.3菌落培养

　　1.3.1菌株来源：植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)和大肠杆菌(Escherichiacoli)均为本实验室前期分离和鉴定的菌株，对应的NCBI编号为KY038178[13]和ATCC25922[8]。

　　1.3.2不同温度下培养：控制两菌接种量一致，分别从OD值为1的培养瓶中各取两菌原菌液1mL，离心后弃上清液加入PBS磷酸盐溶液震荡洗涤，再离心，重复两次;加入100mLPBS，超净台中将两菌株混合，涂布固体平板酪蛋白食物表面后装入盛有沾水纱布的密封袋中，分别放入25℃、30℃、35℃恒温培养箱中培养48h;培养完成后在-80℃下速冻24h，解冻准备实验。

　　1.3.3不同接种比例培养：控制培养温度一致，取OD值均为1的两菌原菌液1mL，按上述步骤离心洗涤两次后，加入100mPBS，通过倍比稀释，将原菌液稀释至适合浓度后接种。

　　1.3.4乳酸平板食物培养：制作空白酪蛋白食物时，食物灭菌后超净台中加入乳酸，振荡摇匀，乳酸食物浓度分别为25、50、75、100mmol/L，制作平板食物，培养步骤同空白组相同。

　　1.4混合菌落计数

　　检测平板食物表面发酵后两菌数量，超净台中取发酵后的平板食物1/4，放入盛有10mLPBS缓冲液中震荡摇匀，取100m，倍比稀释后注入选择性固体培养基MRS和麦康凯，涂布均匀后培养计数植物乳杆菌和大肠杆菌数目。

　　1.5果蝇产卵行为检测

　　实验选用中空透明圆柱体为双向产卵装置，高80mm、直径60mm，底部放入用于产卵的培养皿[14]。果蝇食物经121℃高压蒸汽灭菌20min，稍许冷却倒入平板。将100m无菌水或混合菌群涂布食物表面，密封袋中规定温度下培养48h。用刀片沿中线切为两半，无差别拼装成双选择果蝇产卵培养基。每个产卵器中放入黑腹果蝇雌性20只雄性10只，使用酵母平板育肥2-3d;无伤害放入产卵器产卵12h，产卵结束取下食物平板，显微镜下计数果蝇胚胎数量。产卵指数(OI)=(实验组卵数-对照组卵数)/(实验组卵数+对照组卵数)[12]。

　　1.6存活率实验

　　使用酵母膏育肥果蝇后将其转移至产卵装置中，用葡萄汁琼脂板(700mLH2O，300mL葡萄汁，30g琼脂，30g蔗糖)收集8h新产的卵，分别转移40粒卵对照组和实验组食物上，在培养箱中规定条件下孵育，每天记录胚胎成蛹数量及成蛹后羽化数量。存活率=蛹或成虫数目/总卵数目×100%。实验重复3次。

　　1.7数据分析与作图

　　使用Excel软件整理分析数据，每组数据得平均值(mean)和标准误(SE)，用SPSS24.0软件对各处理组间的差异进行t检验分析(Studentt-test)。用GraphPad和AdobeIllustrator软件完成相关图的制作。

　　2结果和分析

　　2.1混合菌影响果蝇产卵偏嗜性

　　分别将植物乳杆菌、大肠杆菌和二者1：1混合涂布到果蝇食物上，37℃培养48h，处理后食物与对照组食物拼接成双选择产卵地点，分别检测上述三种处理对果蝇产卵偏嗜性的影响。实验结果显示，雌性野生型果蝇OregonR(OR)将88.5%卵产在植物乳杆菌培养的食物一侧，产卵指数(ovipositionindex，OI)为0.77，说明植物乳杆菌可吸引果蝇产卵。相反，果蝇将90%卵产在大肠杆菌培养的食物一侧，OI为-0.80，说明大肠杆菌排斥果蝇产卵。

　　以上结果说明不同种细菌可以引起果蝇截然相反的产卵偏好性。另一个野生品系CantonS(CS)对植物乳杆菌、大肠杆菌处理后食物的OI分别为0.81和-0.84，与上述OR果蝇产卵偏嗜性一致，可排除果蝇遗传背景的影响，也与包括我们在内的前人报道相一致[8,13]，说明这种产卵偏嗜性为果蝇特有的行为。这两种细菌可分别作为吸引和排斥果蝇产卵的代表性菌株，为研究混合菌群影响果蝇产卵偏嗜性提供了很好的素材。首先等比例混合植物乳杆菌和大肠杆菌，然后将混合菌接种到果蝇食物，检测果蝇产卵偏嗜性。

　　结果发现，当植物乳杆菌与大肠杆菌等比例时，果蝇的OI为-0.46，介于两者单纯培养的OI之间，仍然具有强烈的产卵避性，说明大肠杆菌排斥产卵效应占据优势，大于植物乳杆菌吸引产卵效应，最终表现出果蝇产卵避性。同样，植物乳杆菌与大肠杆菌等比例混合引起CS果蝇产卵避性，果蝇的OI介于两者单纯培养的OI之间。以上结果说明，纯菌株和混合菌可作为重要因子而影响果蝇产卵偏嗜性。

　　3讨论

　　自然界或生物体内都存在着大量的微生物，它们复杂且多样，在空间上和时间上都是动态变化的。在菌群中细菌个体间在不断发生着信息交流，影响微生物群落的平衡。在菌群中不仅有群落内部的交流，细菌也会和外界进行信息交流，对外界不断变化的环境条件做出反应，协调各自基因的表达，实现动态平衡[15]。

　　揭示影响菌群平衡的因素对理解和调控菌群平衡具有重要的研究价值。以益生菌植物乳杆菌与条件致病菌大肠杆菌构建研究模型，研究影响菌群平衡的因素以及对果蝇的产卵行为的影响。首先，在37℃，黑腹果蝇对植物乳杆菌和大肠杆菌具有产卵趋向性和产卵避性，将植物乳杆菌与大肠杆菌等比例混合时，OI为-0.46，介于两者单独培养的OI之间，仍具有产卵避性。改变细菌的初始接种比例可以改变甚至逆转果蝇的产卵偏嗜性。

　　在初始接种数量增加到一定程度时，即使在相同条件下生长情况处于劣势，也会逆转劣势成为优势菌。菌群中细菌占据数量优势成为优势菌之后，对果蝇的产卵效应也占据优势。混合菌中植物乳杆菌和大肠杆菌的最适生长温度不同，因此我们推测温度也是影响菌群平衡的重要因素。25℃，植物乳杆菌与大肠杆菌等比例混合时，果蝇OI为0.41，表现出吸引效应，与35℃时恰好相反。此时菌落数量也显示植物乳杆菌数量占据优势，说明温度影响植物乳杆菌与大肠杆菌的相互竞争，低温能赋予植物乳杆菌以竞争优势。并且接种比例与温度能互作而影响果蝇产卵偏嗜性，低温和接种数量优势下OI要高于两者单独情况下的OI。

　　在有限的空间和资源下，菌群中不同细菌会形成不同的社会关系，其中最为显著的便是共生与竞争，在共生中细菌间既有求同也有存异[16]，而在竞争中细菌之间为争夺有限的空间和资源，可以抑制甚至杀死其他微生物[17]。混合菌中益生菌植物乳杆菌和条件致病菌大肠杆菌呈相互竞争状态，植物乳杆菌可抑制大肠杆菌的生长。在30℃，发现植物乳杆菌的代谢产物，特别是乳酸可以抑制大肠杆菌的生长，而植物乳杆菌灭活细胞则不具备这种作用。植物乳杆菌的代谢产物能影响混合菌的生长平衡，继而调控果蝇产卵的偏好性。微生物能提高果蝇后代的存活率[18]，混合菌中植物乳杆菌占据优势时，蛹存活率显著提高，而大肠杆菌占据优势时蛹存活率极低，混合菌群的平衡能影响果蝇后代的存活率。

　　我们的研究结果表明，接种比例和温度是影响菌群平衡的重要因素，而菌群平衡能调控果蝇的产卵行为，影响其后代的存活率。本研究阐述了影响菌群平衡的重要因素以及混合菌群互作的机制，为混合菌群方面的研究做了很好的铺垫，具有重要的理论意义。通过改变一些外部条件来调节菌群的生长平衡，使菌群朝着有利于宿主的方向生长是一个很好的利用菌群的思路。

　　参考文献

　　[1]HibbingME,FuquaC,ParsekMR,PetersonSB.Bacterialcompetition:survivingandthrivinginthemicrobialjungle.NatureReviewsMicrobiology,2010,8(1):15-25.

　　[2]JiaX,Dini-AndreoteF,FalcãoSallesJ.Communityassemblyprocessesofthemicrobialrarebiosphere.TrendsinMicrobiology,2018,26(9):738-747.

　　[3]BroderickNA,LemaitreB.Gut-associatedmicrobesofDrosophilamelanogaster.GutMicrobes,2012,3(4):307-321.

　　作者：王子光1#，门捷2#，张津1，黄永存3*，刘威2,4*

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