本文摘要：摘要：绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)是目前研究较多的生防菌种之一。十九世纪初，Miguela首次分离，将其鉴定为假单胞菌(Pseudomonas)，并将机会性病原菌绿脓杆菌作为其模式菌株，而后Peix于007年，重新将其分类为绿针假单胞菌亚种(P.chlororaphi)。
摘要：绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)是目前研究较多的生防菌种之一。十九世纪初，Miguela首次分离，将其鉴定为假单胞菌(Pseudomonas)，并将机会性病原菌绿脓杆菌作为其模式菌株，而后Peix于007年，重新将其分类为绿针假单胞菌亚种(P.chlororaphi)。目前该菌种已报道有个亚种，均可产生有颜色的吩嗪类化合物抗生素。该种的菌株多分离自植物根际，对植物抵抗病原菌、线虫等的侵染起到保护作用。本文结合我们分离获得的一株绿针假单胞菌的功能研究、基因组分析及相关文献资料，系统描述了绿针假单胞菌的分类学特征、基因组特点、代谢产物功能及其应用开发前景等，以期为绿针假单胞菌在活性代谢产物发掘、基因功能研究及其农业应用等方面提供借鉴。
关键词：绿针假单胞菌，生防，次生代谢产物，农业应用
土壤环境一直被视为微生物资源开发的天然宝库，土壤中存在很多具有促进植物生长、抑制植物病原菌活性的微生物[1]。这些具有生防功能的根际促生菌，在维持植物正常生长、抵抗病原生物等方面发挥了至关重要的作用。假单胞菌(Pseudomonas)作为普通生境优势细菌属之一，广泛活跃于植物周围(包括植物根际与叶面)，其属内很多菌株为植物根际促生菌(PlantGrowth-PromotingRhizobacteria，PGPR)，这些菌株定植于植物根际，帮助植物抵御病害并促进植物的生长[2-3]。
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作为生防领域最具应用潜力的菌株，假单胞菌属主要从以下三个方面发挥其生防功能：(1)合成抗生素抑制病原生物。生防假单胞菌可分泌多种类型的抗生素，其代表为吩嗪类抗生素，如吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylicacid，PCA)、绿脓菌素(Pyocyanin，PYO)等[3];(2)部分假单胞菌具有合成和分泌铁载体能力，可将土壤中的Fe3+转化成为可被细胞吸收的Fe2+的形式，以促进植物生长。另外，菌株可以通过对铁元素竞争，从而抑制病原菌生长[2,4]。(3)存在诱导因子，诱导植物产生系统抗性(inducedsystemicresistance，ISR)。如荧光假单胞菌WCS358存在多个诱导因子，均能使拟南芥产生ISR[2,5-6]。
绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)是公认的环境友好型植物促生菌，该菌株分布范围广，对生态环境具有较强适应能力。大多数绿针假单胞菌是从植物根际分离获得，菌株的代谢产物对植物具有一定的保护作用，具有生防的潜力与应用前景，因此该菌株获得生防领域的广泛关注[7-8]。本文拟在绿针假单胞菌分类学特征、活性代谢产物、菌株生防功能的基础上，发掘其农业上的开发应用前景，结合目前实验室的科学方法和技术，为进一步揭示其基因功能和调控机理提供可能与借鉴。
1绿针假单胞菌的分类地位与基本特征
十九世纪初，MIguela首次分离获得绿针假单胞菌，并将其鉴定为假单胞菌[8]。绿针假单胞菌的分类鉴定较为复杂。起初，菌株Pseudomonaschlororaphis，Pseudomonasaureofaciens和Pseudomonasaurantiaca均被认为是假单胞菌属中的独立的种。
直到1989年，Johnson和Palleroni基于DNA同源性及其表型等特点，提议将P.aureofaciens作为P.chlororaphis同种异型菌株[9]。2005年，在第二版的伯杰氏系统细菌学手册Palleroni将P.aureofaciens和P.chlororaphis合并为P.chlororaphis，但此时P.aurantiaca仍然被许多研究者作为独立的种在使用[9-11]。2007年，Peix基于菌株的表型特征及分子生物学的相关数据，将绿针假单胞菌的相关菌株重新分类，将其命名为P.chlororaphis，并包含三个亚种，分别为P.chlororaphissubsp.aurantiaca，P.chlororaphissubsp.chlororaphis和P.chlororaphissubsp.aureofaciens[10]。010年，绿针假单胞菌增加一个新的分枝—绿针假单胞菌双鱼亚种(.chlororaphissubsp.piscium)[12-13]，该菌株分离自鱼的肠道内。之前研究较多的、分离自番茄根际的菌株CL1391，也属于该亚种[8]。
本实验室之前在番茄根际土壤中分离获得菌株PS41，经16SrRNA测序比对，鉴定为绿针假单胞菌致金色亚种P.chlororaphissubsp.aureofaciensPS41[14]，该菌株可产生挥发性物质抑制黑斑病病菌的生长，并对秀丽隐杆线虫具有高效毒杀活性[14-15]。绿针假单胞菌是革兰氏阴性菌，好氧，可运动，菌体呈绿色、黄色或橙色的γ变形菌纲[8]。典型的绿针假单胞菌株具有定植于植物的能力，并具有抑制植物病原菌的活性[1]。
Peix等人也讨论了绿针假单胞菌亚种之间的一些可变表型，比如潜在的反硝化的能力，以阿拉伯糖或葡萄糖酸盐作为碳源的潜能[10,13]。绿针假单胞菌在营养丰富的培养基上生长时，不同亚种之间存在一些可视的识别特征即色素，这些色素的产生与绿针假单胞菌产生的抗真菌类物质吩嗪(henazines)有关。菌株PS41产生的次级代谢产物主要介导了对病原生物的拮抗作用，这些次级代谢产物是受双组分调控体系GacGacA调节[1]。
2绿针假单胞菌的活性代谢产物研究
2.1绿针假单胞菌产生的抗生素
绿针假单胞菌可以合成多种拮抗病原菌的抗生素(吩嗪衍生物，HCN，铁载体等)，而这些代谢产物的特性决定了绿针假单胞菌的生防潜质及应用前景。绿针假单胞菌可产生特征性色素，其中P.chlororaphissubsp.chlororaphis呈现出绿色，P.chlororaphissubsp.aureofaciens产生金黄色色素，P.chlororaphissubsp.aurantiaca呈现出橙色，P.chlororaphissubsp.piscium可产生绿色与橙色两种色素。
在产生抗生素的种类方面，不同的亚种之间也有明显的区别，P.chlororaphissubsp.aurantiaca和P.chlororaphissubspaureofaciens产生的抗生素种类类似，主要有吩嗪羧酸，羟基吩嗪羧酸(hydroxyphenazinecarboxylicacid，OHPCA)，硝吡咯菌素(Pyrrolnitrin，Prn)，hexyl,5propylresorcinol[16];P.chlororaphissubspchlororaphis产生的抗生素主要有吩嗪甲酰胺(Phenazine1carboxamide，PCN)，吩嗪羧酸，羟基吩嗪羧酸，硝吡咯菌素，hexyl,5propylresorcinol[17];P.chlororaphissubsppiscium产生的抗生素种类相对较少，主要为吩嗪甲酰胺和吩嗪羧酸。
2.2吩嗪类化合物的特点和功能
自然界中，天然的吩嗪化合物为色彩丰富的含氮次生代谢产物，合成于细胞生长的稳定期，这类化合物对植物细胞的生长发育无显著影响，但本身具有广谱抗菌性，可用于防治植物真菌性病害[18-19]。有研究表明，产吩嗪类化合物的微生物对环境具有更好的适应性。绿针假单胞菌在富营养的培养基上生长时，可产生色素，这也是分离鉴定该菌种的一个标志性特征，而这种色素的产生主要归因于该种菌株产生三环含氮物质—吩嗪，吩嗪具有抗菌的功能，能影响细胞的信号[20]。
假单胞菌是最早被发现的吩嗪类物质产生菌，在很长一段时间内，假单胞菌被认为是唯一产生天然吩嗪类化合物的菌属，其中荧光假单胞菌通常只合成一种吩嗪类化合物(吩嗪羧酸)，而其他的假单胞菌则可以产生两种或以上的吩嗪类物质[3,21-22]。绿针假单胞菌株CL1319、P72和T66等，均可高效合成吩嗪类化合物。吩嗪类化合物在菌株与植物互作过程中发挥了重要的作用[20]。例如菌株CL1319产生的吩嗪对尖孢镰刀菌具有较高的抗真菌活性[23]。吩嗪类化合物作为高效的抗菌剂，对环境友好，具有良好的农业应用与开发前景。
假单胞菌合成的吩嗪化合物主要具有种功能：抑制植物病原微生物和线虫的侵染，保护植物[3];菌株在产生吩嗪类化合物和形成生物膜过程中，可促使植物的根际分泌可被菌体利用的营养物质，二者互利共生[3];、可诱导番茄和大豆等植物的系统抗性。此外，吩嗪类化合物还能够改变环境的理化性质[3,24]。
2.3硝吡咯菌素和间苯二酚的抗菌作用
除吩嗪之外，绿针假单胞菌还可以产生其他代谢产物帮助植物抵抗微生物病原菌，如：硝吡咯菌素和间苯二酚[7]，这些物质在植物本身的抗病体系中发挥了重要的作用。硝吡咯菌素是含有吡咯环的化合物，对多种真菌具有抑制作用，这一类抗生素在人类医药和农用杀菌剂领域都有商业化应用[25]。菌株CL1606虽然也能产生吩嗪，但是其产生的hexylpropylresorcinol是防治鳄梨白腐病的关键物质。而绿针假单胞菌PA23产生吡咯硝酸盐是其控制油菜白腐病的主要抗菌物质，而非吩嗪。菌株05产生的吡咯硝酸盐是抑制赤霉病菌的主要代谢产物[26]。因此，硝吡咯菌素和间苯二酚在绿针假单胞菌协助植物抵抗病原菌的过程中也发挥了重要的作用。
2.4氰化氢的杀虫功能
绿针假单胞菌能够产生氰化氢(CN)—由甘氨酸组成的一种简单的水溶性挥发物质。绿针假单胞菌A23的杀线虫活性与其产生的硝吡咯菌素和氰化氢均有着密切的关系[27]。另外，Flury等人对绿针假单胞菌CL1391的研究显示，氰化氢是该菌株毒杀线虫幼虫的关键组分，而非吩嗪或吡咯菌素[28]，绿针假单胞菌株产生的氰化氢可导致线虫[29]和蚜虫细胞死亡[30]。
2.5挥发性有机物(Volatileorganiccompounds,VOCs)的生防功能
目前，微生物产生的挥发性有机物的功能研究吸引了很多学者的关注，研究表明挥发性有机物可以通过长距离扩散从而保护植物。由于微生物代谢的多功能性，一些自然界中原本不存在的挥发性物质，很可能会在微生物生长的过程中被释放出来，从而具有一些特殊的功能。
已有报道绿针假单胞菌可产生挥发性物质帮助植物抵抗病原菌，例如，致金色绿针假单胞菌PS41可以产生挥发性物质甲基丁醇、甲基丁醇和苯乙醇，对甘薯黑斑病菌有抑制作用，该菌株产生的挥发性物质辛酸乙酯对秀丽隐杆线虫C.elegans具有高效毒杀作用[14-15]。绿针假单胞菌和KNU17P可以产生碳氢化合物和十一烷;在菌株和71的代谢产物中，也检测到了含硫的化合物组分，例如硫化氢、二甲基硫醚和甲硫醇等[31]。这些代物一方面可能直接抑制植物病原菌，另一方面可能与诱导植物防御反应有关。在微生物定殖于植物或其他寄主的条件下，产生的多种挥发性有机物，可以建立一种信号或一种鸡尾酒式的OC混合物的作用模式，对于进一步研究绿针假单胞菌的生防机制具有深层次的意义。
3绿针假单胞菌基因组与功能基因簇研究
绿针假单胞菌作为根际共生细菌，其能影响植物生长，并在控制植物病害和提高作物产量等方面具有广阔的应用前景，因而对于该菌株的研究也逐步深入。绿针假单胞菌的主要研究方向包括菌株产活性物质的分离筛选、代谢途径的研究、菌株生物膜的形成、群体感应体系、双组分调节系统，而这一系列的研究都与菌株的基因组学关系紧密，基因组学的研究也成为构建该菌株基因资源库的理论支撑。近年来，绿针假单胞菌基因组数据不断完善，为该菌株的基因组改造的实施奠定了基础[16]。
4绿针假单胞菌的应用研究现状
绿针假单胞菌可以合成多种抗生素，具有抵抗病原生物的作用，绿针假单胞菌还具有较强的植物根际促生能力，使其在农业和园艺领域得以广泛应用[47]。绿针假单胞菌对多种植物有防病促生作用[48]，能增强植物的抗逆性[49-50]、对环境友好、对生物无致病性[51]。
例如，防治番茄枯萎病[52]、烟草疫霉病[53]、辣椒疫霉病[54]、柏树溃疡病[48]和豆类炭疽病[55]等，同时对几种农业重要病原细菌有明显的抑制作用，如荚壳伯克霍尔德菌(Burkholderiaglumae)、解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora)、密执安棒杆菌(Clavibactermichiganesis)、胡萝卜果胶杆菌(Pectobacteriumcarotovora)、丁香假单胞菌(Pseudomonas.yringae)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)等[56]。
绿针假单胞菌中的很多菌株已被广泛且深入研究。菌株3084可合成吩嗪羧酸、羟基吩嗪羧酸和羟基吩嗪等抗生素，可以有效抑制小麦全蚀病[57]。而菌株PCL1391合成吩嗪羧酸和吩嗪甲酰胺，可有效抑制番茄病原菌尖孢镰刀菌和可可棕榈病原菌群结腐霉[58]。
菌株O6能合成藤黄绿菌素、吩嗪羧酸、羟基吩嗪羧酸和羟基吩嗪等物质抑制病原菌，同时可以诱导系统抗性，维持烟草叶和黄瓜叶的健康生长[59]。菌株P72可以合成吩嗪羧酸、羟基吩嗪羧酸和羟基吩嗪三种吩嗪化合物。菌株A23产生的硝吡咯菌素和氰化氢具有杀线虫活性[27]。
菌株SPS41产生的挥发性有机物辛酸乙酯和乙酸乙酯等具有高效的杀线虫活性[14]。绿针假单胞菌产生的代谢产物具有多样性，而其作为根际细菌具有防治病原菌、杀虫等功效，其产生的挥发性物质在果蔬采后的保存过程中，也具有重要作用[15]，菌株PS41产生的挥发性气体甲基丁醇、甲基丁醇和苯乙醇对甘薯黑斑病病菌有显著的拮抗作用，克服了化学农药在防治甘薯采后黑斑病中存在的污染环境、毒素残留、威胁人类健康、催生抗药菌等问题，在果蔬的采后保存中具有潜在的应用价值[15,60]。
5结语和展望
绿针假单胞菌作为生防细菌资源应用在农业及食品业具有显著的优势。一方面，绿针假单胞菌来源方便，广泛分布于普通土壤环境及植物根际;另一方面，这类菌株是环境友好型微生物，菌株无毒性无污染，不会对人体造成伤害，也不会污染环境，应用于农业及食品业具有安全性。美国环保局认证了绿针假单胞菌为非人体、野生动物及环境病原菌，部分相关的商业产品已经应用[1]。除此之外，绿针假单胞菌可分泌抗生素和铁载体，并且在特定的环境下可以诱导系统抗性以及促进植物生长，这些优势都为绿针假单胞菌的广泛应用奠定了基础。
目前，国际上研究报道较多的是利用绿针假单胞菌防治真菌和卵菌病害。绿针假单胞菌在生防制剂的商业应用主要包括代谢产物的应用和菌株细胞的应用。在代谢产物应用方面，绿针假单胞菌基因组学、转录组及代谢组学的研究成果，为该菌的基因修饰从而高效产生特定代谢产物提供了理论依据。绿针假单胞菌的基因组学分析显示，四个亚种共挖掘到类、43个基因簇，而个亚种共同的基因簇只有个，说明绿针假单胞菌中还有大量未开发的次级代谢产物。
绿针假单胞菌可产生多种高效抗生素抑制病原生物，产生吲哚乙酸促进植物生长，产生应用于食品工业的羟基苯甲酸及其衍生物，这些都是可以进一步发掘的资源。针对不同的需求，可通过对菌株的代谢途径进行合理设计和遗传学修饰，改造细胞特性从而应用于实际生产中。
该菌在代谢产物方面的应用潜力，可以从以下几个方向深入发掘：(1)通过分离代谢产物，发掘其产生的功能型抗生素;(2)高通量筛选抗生素高产菌株，为菌株的生防和工业应用提供资源;(3)以最小基因组方法，设计工程菌株，从而在节省资源的基础上并高效获得代谢产物;(4)克隆表达抗生素合成的基因簇，构建工业生产菌株，高效表达抗生素。
菌株细胞主要可应用于农业，作为生防制剂使用，以达到对植物的抗病促生作用，同时克服了化学农药的弊端，从而成为真正的绿色农药。在生物防治领域，绿针假单胞菌代谢产物具有多样性，可高效合成吩嗪，氢化氰及挥发性有机化合物，对病原微生物、昆虫和线虫具有拮抗作用;菌株本身可形成生物膜，有利于其在植物根际的定殖，发挥促生防病功能。总之，绿针假单胞菌具有的促进植物生长、生物防治病虫害，以及产生丰富活性次生代谢产物的能力，使其在农业应用上具有较好的开发前景。
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作者：张春媚，徐明洁，李雪威，邢珂，秦盛
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