本文摘要：摘 要:目的 重组合异种骨(RBX)作为一种新型植骨材料在临床治疗骨缺损、骨不连等病例中取得了显著疗效.需进一步研究重组合异种骨中诱骨活性蛋白的相对分子质量范围. 方法 采用肝素亲和层析技术纯化RBX中诱骨活性蛋白即骨形态发生蛋白(BMP)，利用小鼠肌袋实验
摘 要:目的 重组合异种骨(RBX)作为一种新型植骨材料在临床治疗骨缺损、骨不连等病例中取得了显著疗效.需进一步研究重组合异种骨中诱骨活性蛋白的相对分子质量范围. 方法 采用肝素亲和层析技术纯化RBX中诱骨活性蛋白即骨形态发生蛋白(BMP)，利用小鼠肌袋实验检测其骨诱导活性，再用聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)测量RBX中诱骨活性蛋白纯化后的相对分子质量. 结果 在纯化近20倍后，获得8.23mg高度纯化的蛋白质，组织学观察其活性发现植入小鼠股部第10日，有大量软骨细胞及软骨岛的出现，在局部区域还可见到条索状骨小梁出现，SDS-PAGE电泳发现这种蛋白质的相对分子质量为35×10 3 ，经还原后单体的相对分子质量为22×10 3 . 结论 重组合异种骨(RBX)中35×103 的蛋白质经还原后为22×103 ，其单独使用具有异位成骨活性，为RBX的临床应用提供了理论依据.
关键词: 骨折愈合;蛋白质类/分离和提纯
0 引言
骨移植在治疗骨折不连接或延迟连接等多种原因造成的骨质缺损中应用广泛，但异种骨移植的临床应用尚未完全解决.重组合异种骨(RBX)的发明为骨移植的临床应用开辟了新的领域，它是将具有诱骨活性的牛BMP与无抗原性的松质骨复合，临床修复骨缺损、骨不连取得了良好的效果.但RBX中具有诱骨活性的BMP是从牛骨中初步提取的，我们还不确切知道RBX中诱骨活性成份(BMP粗提物)的分子质量，及它与RBX活性的关系.对其中起决定作用的诱骨成份尚不清楚.我们将天然提取的蛋白进一步分离、纯化与分析，探讨其中诱骨成份的作用机制，为重组合异种骨的临床应用提供可靠的理论依据.
1 材料和方法
1.1 重组合异种骨的制备
参考Urist等[1] 的报道，各个过程持续时间与试剂用量因初始骨粒不同而做了调整.选取新鲜小牛四肢骨骨干制成骨粉，经脱脂、脱钙及去除低分子量蛋白多糖等成份后，将其形成的骨基质明胶溶于提取液(6mol・L-1 脲/0.5mol・L-1 GaCl/1mmol・L-1 NEMI)24h，提取上清，经透析、离心后得到粗制BMP，将其复溶于纯化液(4mol・L-1 盐酸胍/0.5mol・L-1 GaCl/1mmol・L-1 NEMI)，上清再经透析、离心后得到了部分纯化的BMP.在0.08MPa负压下将其与牛松质骨载体(本校西京医院自制)按1∶5质量比复合，蒸馏水透析72h，冻干.
1.2 肝素亲和层析纯化
取160mg部分纯化的蛋白复溶于10mL的平衡缓冲液中(Buffer A:6mol・L-1 脲/50mmol・L-1 Tris.HCl/0.1mol・L-1 NaCl pH7.0)，以20000g的速度离心30min，除去其中不溶的物质.用上清对160mm×10mm的肝素亲和层析柱加样(注意不要破坏凝胶表面).层析柱分别按次序用以下三种缓冲液洗脱，即含有0.1，0.15，0.5mol・L-1 NaCl的Buffer A溶液，分别收集洗脱下来的蛋白质，经透析、离心、冻干后保存，测质量.
1.3 生物活性检测
选用雄性BALB/c小鼠(第四军医大学实验动物中心供给)10只，体质量(20±2)g，随机分成2组，每组5只.将冻干后的蛋白分别植入小鼠右侧股部肌袋中，其中A组植入0.4mg纯化后的蛋白质，B组同时植入牛血清白蛋白作为对照.在术后第10日全部处死，取出植入物周围2cm的软组织.标本均经组织学常规处理，切片行HE染色，镜下观察异位成骨的情况.
1.4 蛋白相对分子质量的测定
采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，它多用于蛋白质及核酸的Mr 测定.将纯化后的蛋白质溶于含有二硫苏糖醇(DTT)或不含有DTT的样品缓冲液中，90℃加热3～5min，离心后用上清加样.电泳凝胶为50mL・L-1 的积层胶、125mL・L-1 的分离胶.电泳完毕后，用考马斯亮蓝R-250染色，再测其相对分子质量.
2 结果
将部分纯化的蛋白质加入层析柱后，洗脱液以120cm・h-1 的速度洗脱(Fig1所示).用Buffer A洗脱时，未吸附的蛋白质基本都流出;改用Buffer B液(含有0.15mol・L-1 NaCl)，洗脱吸附较弱的蛋白，从Fig1可见此时pH值下降，离子浓度增加，且有较大量的杂蛋白流出，称为B峰;用含有0.5mol・L-1 NaCl的Buffer C液洗脱时，获得C峰，此峰为我们主要收集的目的蛋白.A段蛋白与肝素亲和层析无亲和力，故弃去不用，将B峰、C峰收集的蛋白对四蒸水进行透析约24h，其间换液3次.透析发现，C峰蛋白有白色絮状沉积，表明不溶于水;而B峰蛋白透析液仍澄清透明，均溶于水.将C份蛋白真空冻干后，测其质量为8.23mg，纯化近20倍.
手术后的动物均未出现感染，生长良好.小白鼠于术后第10日处死，切片经HE染色后观察发现，A组所有标本切片上均可见到明显的软骨岛形成，软骨细胞大而圆，非常明显，在个别区域可看到条索状骨小梁的出现(Fig2)，周围有少量淋巴细胞浸润;B组无任何变化.
重组合异种骨自1988年发明以来，至今已用于千余例植骨术中，主要治疗骨不连、延迟连接和骨缺损等[2] .随访发现，治愈率达90%以上，引起国内外骨科专家关注.RBX中诱骨活性蛋白(即部分纯化的BMP)来源于小牛四肢皮质骨，提取方法参考Urist等[1] 的传统方法，经十余年的摸索、总结，建立了一套特有的工艺程序[3] .
RBX的动物实验与临床应用都证实它具有较强的诱骨活性，但其中诱骨成份到底如何，目前尚不完全清楚;部分纯化的BMP活性往往优于高度纯化的BMP[4] ，其原因是否是由于纯化过程中丢失了某些具有较强活性作用的蛋白质，因而本实验试图探讨RBX中具有较强活性的蛋白的相对分子质量范围.BMP的纯化多采用离子交换层析、羟基磷灰石层析、葡聚糖系列凝胶层析及高压液相色谱等方法.其中亲和层析由于具有操作方便、重复性高及纯化的蛋白纯度高、在透析后仍具有较高的生物活性，得到许多学者的认同，在BMP的纯化中取得了良好的结果
[5，6] .本实验采用肝素亲和层析，依靠离子间作用力洗脱.实验操作分为2步，首先用含有0.15mol・L-1 NaCl的洗脱液洗脱，将一些与肝素非特异性结合的蛋白质先洗脱下来，再用高浓度液进行洗脱，将肝素高亲合的BMP洗脱下来，获得较高的纯度.对160 mg的部分纯化BMP进行纯化，获得与肝素具有高亲和力的蛋白8.23mg，它在水中呈白色絮状沉淀，溶解度较低.体内实验中，将0.4mg纯化后的蛋白质植入小鼠股部肌肉内后，第10日发现有大量软骨细胞、软骨岛形成，软骨细胞大而圆，非常明显，并可见有条索状骨小梁形成，此高度纯化的蛋白质可以诱导未分化的间充质细胞分化为软骨与骨，是具有异位成骨的能力.
在SDS-PAGE电泳中(Fig4)，纯化后的蛋白Mr 为35×103 ，如在样品缓冲液中加入二硫苏糖醇(DTT)，经还原处理后，Mr 为22×103 .DTT作为一种变性剂，较十二烷基硫酸钠(SDS)作用更强烈，它可将蛋白质各链间的二硫键断开，这样具有空间结构的蛋白质就变成线状的蛋白链.所以这种经高度纯化、具有较好活性的蛋白质在体内是由同源二聚体构成的，单体Mr 为22×103 ，与文献报道一致:Luyten FP[6] 采用肝素亲和色谱、羟基磷灰石等层析后发现，其活性蛋白Mr 为(30～40)×103 之间，经还原后Mr为22×103 .Sampath TK
[5] 等也得到相似的结论，他们称此为成骨素(osteogenin).经氨基酸序列分析发现与BMP
-3 有较高的同源性，但它不象重组BMP-3 在体内只能诱导软骨形成，它还可诱导成骨.
另外，Wang等[7] 及Urist等[8] 都提出牛BMP的Mr 为(18.0±0.5)×10
3 .他们在提取过程中主要采用Sephacryl或Sepharose系列层析柱及离子交换层析柱或羟基磷灰石柱等，得到了30×103 的蛋白，还原后为30×103 ，18×103 ，16×103 ，其中认为18×103 的蛋白为真正的BMP，而30×103 ，16×103 的蛋白对于18×103 的BMP活性是不可缺少的.1990年有学者Sampath TK [9] 对BMP活性部分继续研究，碳端氨基酸序列分析18×103 ，16×103 蛋白分别与OP-1，BMP-2同源性达到42%，47%，他认为天然BMP是由异源二聚体组成，两条单链与BMP-2，OP-1的同源性很高.
不同的学者对BMP采用不同的提取与纯化方法，得出不同的结论.这可能是与使用肝素亲和色谱有关，有文献报道BMP-3分子上有与肝素结合的位点[5] ，故采用此方法纯化，能够得到与Urist等[8] 不同的结果，有学者认为这种蛋白类似于BMP-3.
重组合异种骨诱骨活性成份中高度纯化的BMP的获得，及Mr 的测定对于RBX的临床应用、进一步推广提供了可靠的理论依据.但由于条件有限，蛋白质的氨基酸序列分析及与粗提BMP活性的比较等某些问题，尚需进一步实验研究.
参考文献:
[1]Urist MR，Mikulski A，Lietze A.Solubilized and insolubilized bone morphogen-etic protein [J].Proc Natl Acad Sci，1979;76(4):1828-1832.
[2]Luo ZJ，Hu YY，Wang Q.Antigen-extracted bovine cancellous bone block/bBMP composite graft in repairing segmental radial diaphysial defects in rabbits [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;1:48-52.
[3]Guo Z，Hu YY，Lv R，Wang J.The modulation of BMP on ex-pression of TNF-αand IL-6gene in the area of implanted xeno-geneic bone [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;1:41-45.
[4]Bessho K，Tagawa T，Murata M.Analysis of bone morpho-genetic protein(BMP)derived from human and bovine bone ma-trix [J].Clin Orthop，1991;268:226-234.
[5]Sampath TK，Muthukamaran N，Reddi AH.Isolation of os-teogenin，an extracellular matrix-associated，bone-inductive pro-tein by heparin affinity chromatography [J].Proc Natl Acad Sci USA，1987;84(10);7109-7113.
转载请注明来自发表学术论文网：http://www.fbxslw.com/yxlw/3012.html
